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fantasia diary*
ほどよくダラダラをモットーに。
アコギをゴロゴロ弾くように。
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2004年10月11日(月) 明日実習試験
（タンパク質の定量）
標準タンパク質溶液：1mg/mL ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液
希釈溶液：ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）
倍々希釈（同じ量のＰＢＳを入れておいて、溶液混ぜたのを半量ずつ移していく）
●Bradford法（ＣＢＢ法）→570nm
マイクロプレート用イムノリーダーで読む
検量線は濃度の薄いところを優先して直線で引く→未知試料の吸光度から濃度を読む
●紫外吸収法→280nm
石英セルを使って直接吸光度を測定
スポットが直線に分布してるので０を通る検量線→未知試料の吸光度から濃度を読む
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＳＤＳの働きはタンパク質の電荷の違いをなくして分子量で分けられるようにすること。
分子量既知のタンパク質を一緒にゲルに流して、タンパク質の分子量を求める。
ＴＥＭＥＤ：重合促進剤
分離用ゲルを入れて固まってから、濃縮用ゲルを入れて固める。
泳動槽に泳動用緩衝液を入れ、試料を加熱してからゲルに入れて、泳動。
見ているバンドの距離を一番下のバンドの距離で割ったものが比移動度。
（未知検体の移動距離 / 原点からの移動距離）
マーカーの比移動度を使ってグラフを書くとちょっとへこんだ左上がりの検量線→
未知試料の比移動度から縦軸の分子量（片対数）を読む
グロブリンの長いＨ鎖と短いＬ鎖が２本バンドが出てるのが過去問にいたり。
Ｓ−Ｓ結合が切れて２本出るとかなんとか云々。
（免疫電気泳動法）
ゲル内でのタンパクの電気泳動法と免疫拡散法を組み合わせた方法。
ゲル平板の中央に穴を開け、そこには抗原を入れる。
上と下に入れる横長の溝には抗体を入れる。
今回下が全血清抗体、上の溝は右半分だけで、ＩｇＧ抗体。（ウサギ抗ヒト）
ウサギ抗ヒト全血清抗体→ウサギにヒトの全血清（抗原）を注射して出来た抗体
泳動はトリス緩衝液。
分子量の小さいほうが沈降線が遠く（縁のほう）に出る。
＋ Alb α1AT α2M Tf IgG −
IgMはIgGの内側に出る。分子量多いから（五量体だ）
（ロイペプチンのトリプシン阻害）
ラインウィーバーバークプロット：
縦軸1/V-Blank（吸光度）
横軸1/S（阻害されるタンパク（今回はＢＡＰＮＡ）の濃度）
切片1/Vmax、左端-1/Km
トリプシンはペプチドの-Arg-、-Lys-のＣ末端側を切る。
しかしロイペプチンがトリプシンを阻害してしまうので、
入れたほうは阻害剤がなくなり、吸光度が低くなる。拮抗阻害のほうは吸光度が高い。
吸光度が高いと色がついてるってことになるかも。過去問。
（プラスミドと制限酵素）
制限酵素：特異配列を認識し切断。今回使うEcoRI、BamHI、PstIはどれも１箇所
プラスミド：菌に入って、耐性遺伝子を導入する。
冷却微量遠心機→上清を取り除く→Lysis bufferを入れて懸濁→攪拌→氷冷→
フェノール / クロロホルム溶液を加える→攪拌→卓上遠心機→
上層（水槽）を別のチューブへ移す→95％エタノールを加える→
氷冷→冷却微量遠心機→上清を取り除く→沈渣に70％エタノール→
卓上遠心機→洗液を除く→乾燥
乾いたら滅菌水に溶かして、もう片方と合わせて１００倍希釈し、260nmで吸光度測定
EcoRI、BamHI、PstIを２つずつ組み合わせたのと３つ全部入れたのを作って、
アガロースゲルにのせて泳動。片対数
マーカーには10000〜250までの決まった分子量のタンパクが入っているので
縦軸が分子量（片対数）、横軸に移動距離をとって、検量線を書き、
バンドの移動距離から断片の分子量を求める。
正解は切れるとこ見つけて計算で出るので、比べる。
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